Reprogrammation


Module 1 : Isolation de fibroblastes à partir d’une biopsie de peau


Ce service permet, dans un laps de temps d’environ 1 mois, d’établir une culture primaire de fibroblastes à partir d’une biopsie cutanée (2 à 4 mm) et d’obtenir environ trois flasques de 25 cm2.
Seulement des biopsies cutanées fraîches seront acceptées. Le requérant s’engage à adopter nos protocoles de prélèvement et de transport pour la biopsie. Selon notre expérience, les phases de prélèvement et de transport sont des étapes cruciales qui, mal réalisées, pourraient être à l’origine d’une incapacité à isoler des fibroblastes.

Module 2 : Reprogrammation de fibroblastes à l’aide du virus de Sendai


Ce service prend environ trois mois pour être complété et inclut :
         Expansion des fibroblastes, détection de mycoplasmes, congélation et ensemencement pour la transduction.
         Transduction de 1 puits (200 000 cellules/puits) avec le virus de Sendaï.   
         Passage et ensemencement sur Matrigel. Changement de milieu de culture à chaque jour.   
         Prélèvement de 5 colonies un mois plus tard.  
         Culture et expansion des colonies.  
         Détection des mycoplasmes.  
         Congélation des lignées.
Si le requérant choisit d’utiliser des fibroblastes à la place d’une biopsie cutanée (module 1), les fibroblastes peuvent être envoyés au laboratoire soit congelés ou soit en culture, selon son choix. Il est obligatoire de réaliser un test de détection des mycoplasmes avant l’envoi. Seulement les échantillons négatifs seront acceptés.
Les fibroblastes devraient avoir un faible nombre de passages (idéalement moins de 10) et être capables de proliférer. Les cultures sénescentes ne sont pas facilement reprogrammables (voir impossible à reprogrammer). Aucun vial de cellules ne sera conservé au sein de notre laboratoire. Les fibroblastes non utilisés seront retournés au requérant.
Les colonies d’iPS obtenues (sur MEFs) sont ensemencées sur Matrigel.

Module 3 : Reprogrammation de cellules sanguines (PBMCs) à l’aide du virus de Sendai


Ce service prend environ trois mois pour être complété et inclut :
         Isolation des cellules mononucléaires circulant dans le sang à partir d’un échantillon de sang total (6mL minimum)  
         Expansion des érythroblastes, détection de mycoplasmes et ensemencement pour la transduction.  
         Transduction de 1 puits (150 000 cellules/puits) avec le virus de Sendaï.   
         Passage et ensemencement sur Matrigel. Changement de culture à chaque jour.  
         Prélèvement de 5 colonies un mois plus tard.  
         Culture et expansion des colonies.  
         Détection des mycoplasmes.  
         Congélation des lignées.